SARS-CoV-2 N逃避変異は迅速抗原検査に影響を与えない

Frank, F. et al. (2022). Deep mutational scanning identifies SARS-CoV-2 Nucleocapsid escape mutations of currently available rapid antigen tests. Cell. doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.08.010. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867422010443

現在進行中のコロナウイルス感染症2019（COVID-19）パンデミックは、640万人以上の死者を出し、新たな感染者も出続けている。ワクチン接種の普及に伴い、ウイルスの蔓延は減少すると予想されていた。ブレイクスルー感染と再感染の発生は、この希望が間違いであることを証明した。

この研究では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）のさまざまな株に見られる逃避変異をマッピングし、抗体による中和や抗体結合に依存する迅速抗原性試験による検出を回避する可能性があることを示した。

はじめに
COVID-19の診断検査は、ウイルスの祖先である武漢変異型のウイルス配列を用いた体外報告により、2020年4月に早くも開始された。新しい変種の出現に伴い、ウイルス抗原を認識して結合する抗体の能力を利用するため、これらの検査の性能に疑問が生じています。この認識は、逃避変異が存在する場合には覆されるのです。

今回、Cell誌に掲載された研究は、このようなNターゲット変異が、迅速抗原検査に用いられる診断用抗体の抗原認識に与える影響を評価する新しい方法を提示するものである。

迅速抗原検査は、SARS-CoV-2の存在を迅速かつ容易に検出することができる検査法である。多くの場合、ウイルス粒子や感染者に豊富に含まれるウイルスヌクレオキャプシド（N）抗原を使用します。Nタンパク質は、ウイルスの複製やパッケージングなど、ウイルスのライフサイクルにおいて重要な役割を担っている。Nタンパク質は、RNA結合ドメイン（N-RBD）と二量化ドメイン（N-DD）を持ち、その周囲に3つの無秩序な領域が存在する。

抗体は、抗体の結合ドメインと相補的な構造を持つ特定の抗原領域であるエピトープに結合する。エピトープマッピングは、構造決定、質量分析、部位特異的変異導入など複数の手法を用いて、抗原上の逃避変異部位を特定するのに役立つ分野である。しかし、現在使われているどの手法も、ある変異が抗体結合に及ぼす影響を直接測定することはできない。

多くの研究者は、変異体またはユニークな配列のライブラリを通じて、タンパク質中のほとんどまたはすべての変異を調べる方法であるディープミューテーショナルスキャン（DMS）に注目している。これらの配列は、関連する変異を濃縮するために、in vitroの選択技術を使用して同時にスクリーニングすることができる。

細胞表面ディスプレイ法と併用して、DMSはSARS-CoV-2スパイクタンパク質と宿主のアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体の相互作用や、スパイクRBDでのスパイク-抗体結合を阻害する重要な変異の研究に役立ってきた。

本研究では、直接定量的な抗体結合アッセイを実現するために、Nタンパク質の表面ディスプレイには哺乳類細胞を使用しています。これを、Nタンパク質の全長に沿って可能な限りのアミノ酸置換を集めたライブラリーを用いたDMSと組み合わせることで、現在このウイルスの検査に用いられている17種類の診断用抗体の抗原結合に対する、すべての可能な変異の影響を完全に測定することができた。

その結果、各抗体に起こりうる逃避変異の全体像が得られ、各領域での逃避の可能性をスコア化することができた。このスコアは、与えられた変異が、エスケープ変異を発現している細胞群にどれだけ多く含まれているかを示している。従って、各変異が抗体結合にどの程度影響を与えるかを示している。

このように、スコアは、エピトープと、エピトープ内またはその近傍の変異に対する診断用抗体の感受性の両方を特定するのに役立つ。このデータは、これらの部位の各変異が抗体認識にどのような影響を与えるかを理解するのに役立ちます。このようにして、N変異配列ライブラリーの全体にわたる抗体結合強度が、起こりうるすべての点変異を考慮して測定された。

研究の成果は何か？
予想通り、ほとんどの突然変異は抗体結合を減少させず、この効果は明確に定義された部位の小さな突然変異のセットに限定されたものであった。これには、R040、C706、3C3のような抗体によって結合されるエピトープが含まれる。前者では、3つの異なる位置でのいかなる変異も結合を低下させるが、別の位置での荷電または極性アミノ酸の変化のみがこの効果をもたらす。

後者2つは、3次元エピトープに結合する抗体の例で、わずかな変異が顕著な抗体結合の減少につながるものである。3C3では、E323の置換はほとんど常に大きな影響を与えるが、V324ではそうではなく、荷電または芳香族アミノ酸の変異のみが結合の減少を引き起こす。

全体として、これは、あるエピトープがある置換には敏感だが、他の置換には敏感でないことを示しており、このプラットフォームで得られる詳細な情報を強調している。

R040のエピトープでは3箇所、C706のエピトープでは4箇所の変異で結合が消失したが、これらのエピトープ以外では、変異は重要ではなかった。興味深いことに、3C3では、2つの変異が結合を消失させ、もう1つは結合親和性を2桁も低下させた。第四の変異は軽い影響しか与えなかったが、他の二つの抗体は、この変異体を通常の結合レベルで検出した。

このことは、後者の突然変異によって引き起こされたタンパク質の部分的なミスフォールディングが、これらの抗体との結合の親和性を低下させるのに不十分であったことを示しています。結合に対する長距離効果は、いくつかのN-RBD変異体でも見られ、親和性の顕著な変化なしに結合が減少する可能性を示している。

この研究により、抗体がNタンパク質に結合する場所について豊富な情報が得られた。また、異なる抗体がそれぞれ特徴的な逃避変異のセットを介してどのように逃避しているかを示し、逃避の基本的なメカニズムの解明に貢献するとともに、重複するエピトープに結合する抗体を識別することを可能にした。

抗原迅速分析は、固相と移動相の2種類の抗体を用い、その両方が抗原に結合することでシグナルを発生させる仕組みになっている。興味深いことに、この研究のデータは、これらの診断用抗体のセットが異なるエピトープに結合することを示しており、あるNタンパク質領域において両者が同じ高いエスケープスコアを持つことはまずあり得ないことを示している。つまり、これらの検査で使用されるすべての抗体は同時に結合することができ、これらの検査の信頼性を検証しているのである。

これらのデータを合わせると、DMSは新しい抗原検査の設計において、適切な抗体ペアの選択を導くために利用できる可能性があることがわかります。"

インプリケーション今回の結果は、SARS-CoV-2の現行型および旧型の変異を検出するための迅速抗原検査の有用性を示している。現在知られているNタンパク質の変異は、検査不合格の原因になることはまずない。

第二に、将来起こりうる点変異を含むすべての点変異に対する結合試験結果を提示することにより、このウイルスの進化とパンデミックの進展をさらに追跡するために重要である。これは、臨床および公衆衛生管理にとって計り知れない価値がある。

繰り返しになるが、DMSと哺乳類細胞表面ディスプレイを組み合わせたこの方法は、現在のゴールドスタンダードである構造エピトープマッピングよりも優れている。なぜなら、変異ライブラリーを用いてあらゆる変異を伴う結合を測定しながら、全長抗原の抗体認識を直接評価するからである。

エピトープを直接同定しないにもかかわらず、抗体特異的なエスケープ変異のフィンガープリントが得られます。これは、抗原変異が抗体結合にどのように影響するかを調べるために、より広く使用することができます。また、どちらかの側のタンパク質を発現させるシステムが考案されれば、一般的なタンパク質間相互作用の研究にも応用できる。

さらに、B細胞の胚中心における親和性成熟のような他のプロセスの理解にも役立つ。特異性の増加に伴う抗体親和性の増加や、抗原変異に対する抵抗性などである。